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激酶藥物篩選(HTRF法)



HTRF 原理

HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)技術基于時間分辨熒光( time resolved fluorescence TRF)和 熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer FRET)兩大技術原理。

時間分辨熒光 (TRF)利用稀土元素中鑭系元素的獨特性質。它們與普通熒光的主要區別是熒光的持續時間不同。普通熒光的半衰期為納秒級,鑭系元素的半衰期是毫秒級,有6 個數量級的差別。所以,在檢測時,TRF 有一個時間延遲--50微秒。經過這個時間延遲,普通熒光的信號幾乎為零。所以,TRF 的背景非常低, 反映樣品的實際情況。

 

熒光共振能量轉移(FRET)技術利用了兩種熒光基團的能量轉移,這兩種熒光基團分別稱為能量供體(Donor)和能量受體(Acceptor)Donor 被外來光源激發(例如氙燈或激光), 如果它與Acceptor 比較接近,可以將能量共振轉移到Acceptor上,使其受到激發,發出特定波長的發射光。

 

Donor Acceptor分別與相互作用的兩個生物分子結合,生物分子的結合可以將Donor Acceptor 拉到足夠近的距離,產生能量轉移。由于Acceptor 的發射光來自于能量轉移,所以在實驗中不需要將未結合與已結合的分子分開,即不需要洗滌步驟。

 

HTRF 的能量供體

HTRF 的能量供體是銪(Eu)和鋱(Tb)的穴狀化合物。在這個穴狀化合物里,Eu Tb 被永久地嵌合在一個籠子里,結構非常穩定。這個結構是由 J.M. Lehn’s 教授發明的,并由此在1987 年獲得了諾貝爾獎。

HTRF的能量受體

HTRF的能量受體也有兩種,XL665d2。它們的光學性質相同,分子量不同。前者分子量為105 KD,實際上就是別藻藍蛋白(APC)。我們將APC的亞基偶聯在一起,使其不能解離,提高了穩定性。后者分子量為1 KD, 在某些實驗中有獨特的優勢。

 

HTRF的操作步驟

HTRF的操作步驟非常簡單,只需要將實驗所需試劑加進去,然后孵 育、檢測即可。

 

HTRF的應用

G蛋白偶聯受體研究:受體第二信使檢測受體配體結合胞內信號分子檢測

激酶活性檢測:胞外激酶活性檢測胞內激酶活性檢測

生物標志物檢測:基于抗體的夾心法和競爭法檢測

抗體檢測:抗體重鏈含量測定、抗體輕鏈含量測定

生物過程分析:GST含量測定、HIS含量測定、CHO宿主蛋白含量測定

免疫過程分析:CD16結合檢測、CD32結合檢測、CD64結合檢測

相互作用分析:蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-DNA、蛋白-RNA

蛋白修飾:蛋白甲基化、蛋白乙酰化、蛋白泛素化、蛋白水解

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 胞外激酶檢測

一,檢測試劑盒
Cisbio激酶檢測,是基于抗體的檢測產物生成的解決方案,其特異性各不相同。包括:
1)基于ADP定量的適用于所有激酶的ADP Transcreener檢測試劑盒;
2)利用通用底物的經過兩百多種激酶驗證的KinEASE 試劑盒;
3)利用特定底物、特異抗體的HTRF工具箱解決方案。
 
二,檢測方法
這所有的檢測方案,操作步驟都是一致的。
1)激酶反應:加入激酶、底物、ATP,室溫進行激酶反應;
2)檢測步驟:激酶反應完畢,加入能量供體Eu和能量受體XL665/d2標記試劑,室溫孵育1小時,讀數。
 
三,實驗步驟示意圖
 
 
四,KinEASE TK試劑盒
KinEASE TK試劑盒適用于所有酪氨酸激酶的檢測。試劑盒提供生物素標記的底物、Eu標記的磷酸化位點特異性抗體、XL665標記的親和素以及緩沖液。激酶將底物磷酸化,Eu-Ab識別磷酸化底物,XL665-SA與底物上的生物素結合。Eu與XL665接近,產生HTRF信號。經過驗證的激酶列表:

五,KinEASE STK試劑盒
KinEASE STK試劑盒是用來進行絲氨酸/蘇氨酸激酶檢測的試劑盒。根據激酶的不同,該試劑盒有三個通用底物可供選擇,分別為S1、S2和S3,經過驗證的激酶有一百多種。對于沒有經過驗證的激酶,可以用Discovery試劑盒確定合適的底物,其中包括了三種底物。
試劑盒的檢測原理與實驗步驟與KinEASE TK試劑盒相同。經過驗證的激酶列表:

 HTRF方法快速高效檢測ZAP-70磷酸化

一、HTRF檢測技術
是基于時間分辨熒光(TRF)和熒光共振能量轉移(FRET)兩大技術原理,而開發的高通量藥物篩選利器。兩種熒光基團分稱為能量供體(Donor,Eu或Tb標記)和能量受體(Acceptor,XL665或d2標記)。當兩者比較接近,通過能量共振可以將能量轉移到能量受體上,使其受到激發,發出特定波長的發射光。 
HTRF檢測試劑盒,就是綜合利用抗原抗體的特異性結合反應,受體供體間能量共振轉移而開發的,高靈敏度,快速免洗,低背景的高通量檢測技術。
二、ZAP-70
是酪氨酸蛋白激酶家族的一員,通常表達在T 細胞和自然殺傷細胞內,是T細胞受體的一部分,在T細胞信號轉導中起重要作用。其319位的酪氨酸磷酸化是T細胞激活的表現之一,通常用來檢測重組蛋白對PD-L1的抑制作用。
 
三、ZAP-70檢測的試劑盒
基于抗體夾心法,用于磷酸化ZAP-70和總ZAP-70檢測的試劑盒,就是將磷酸化ZAP-70,正常ZAP-70蛋白的捕獲抗體和檢測抗體分別標記為能量供體和能量受體,當兩者結合在一起時,即可通過能量轉移信號被檢測到。
 
四、技術特點
4.1 高效簡潔的操作
在一個96孔板里培養,刺激,裂解細胞后,將裂解液轉入384孔檢測板,加入捕獲抗體和檢測抗體孵育30min,即可上機檢測。
 
 
4.2 高靈敏度
T175的培養瓶培養Jurkat細胞,收集細胞懸液用CD3抗體刺激細胞2.5min后,裂解細胞,分別進行HTRF和WB檢測,無論是對磷酸化ZAP-70還是總ZAP-70的檢測靈敏度,HTRF都遠高于WB,詳情參見下圖:
 
 
4.3 免疫檢查應用
 Jurkat細胞分別與不同濃度的重組PD-L1共孵育培養24h后,用CD3抗體刺激后,利用HTFR試劑盒,分別檢測磷酸化ZAP-70和總ZAP-70,并用總ZAP-70量進行校準,進而評價重組PD-L1對CD3引起的Jurkat細胞的ZAP-70磷酸化影響。
 
五、試劑盒信息
 
 

貨號:HTRF001

規格: 1
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